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                                                            首頁 自產產品 技術服務 代理產品 下載中心 聯系我們 快速訂購

                                                            新聞中心

                                                            當前位置:新聞中心 > 企業動態

                                                            TOPO Cloning Kit

                                                            ——2017-11-09

                                                            TOPO Cloning Kit

                                                             

                                                            GT1505-20T  GV TOPO-TA-Amp Cloning Kit適用于Taq DNA聚合酶擴增的末端加“A”的PCR片段的快速克隆

                                                            GT1503-20T  GV TOPO-Blunt-Amp Cloning Kit適用于PfuKOD等高保真聚合酶擴增的平末端的PCR片段的快速克隆

                                                            產品規格:20T

                                                            保存與運輸:-20℃。

                                                             

                                                            一、產品特點

                                                            1、連接只需5 min

                                                            2、載體不含LacZ基因,無需藍白斑篩選。

                                                            3、優質PCR產物(無非特異性條帶、無引物二聚體)可直接進行克隆,無需純化。

                                                             

                                                            二、PCR產物的制備:

                                                            1、擴增引物不能磷酸化。

                                                            2PCR反應結束后,電泳檢測PCR產物產量和質量,若有非特異性擴增或引物二聚體,則需切膠回收目的條帶后進行克隆。

                                                             

                                                            三、操作步驟

                                                            克隆反應:

                                                            1、室溫下,按下表配制反應體系:

                                                            試劑

                                                            添加量

                                                            DNA片段

                                                            0.5-8 μl

                                                            TOPO cloning vector

                                                            1 μl

                                                            10×TOPO Buffer

                                                            1 μl

                                                            ddH2O

                                                            x μl

                                                               連接反應體系的總體積為10μl(用ddH2O補足)。輕彈離心管將反應體系混勻,短暫離心3-5s

                                                               注:整個操作過程均在室溫條件下進行,切勿在冰上操作。

                                                               如果PCR產物電泳檢測僅有很亮的目的條帶,無非特異性條帶和引物二聚體,可取0.5-1μlPCR產物原液直接進行克隆

                                                            2、將離心管于室溫(22-30℃)下靜置0-5 min(不可超過5 min)。反應結束后將離心管放置在冰上,進行后續的轉化操作。

                                                                     注:室溫下(22-30℃)反應時間不可超過5 min,時間過長克隆效率會下降。若室溫較 低,建議使用PCR儀控溫,可設置25℃反應5min。若連接產物未能立即用于轉化,需保存于-20℃。不建議對連接產物做長期保存。

                                                            3、陽性對照實驗:

                                                            1μl試劑盒提供的對照片段進行克隆、轉化后,將菌液涂布在含有相應抗生素的培養平板上,37℃培養過夜。取菌斑進行PCR擴增。

                                                            附:不同長度的DNA片段的最適添加量參照表:

                                                            DNA片段大小(bp

                                                            最適添加量(ng

                                                            100-1000

                                                            20-50

                                                            1000-2000

                                                            50-100

                                                            2000-5000

                                                            100-200

                                                            轉化(此操作需在無菌條件下進行):

                                                             

                                                            1、取5 μl連接產物加入到50-100 μl 剛剛融化的感受態細胞中(感受態細胞應剛從-80℃取出,于冰上融化,剛剛融化便加入連接產物),溫和混勻,冰浴2-30 min

                                                            242℃水浴熱激30s。(勿晃動離心管)

                                                            3、立即轉移到冰上,靜置2 min(冰浴期間勿晃動離心管)。

                                                            4、加入300-500 μl LB培養基(不含抗生素),37℃,200-250 rpm振蕩培養60 min

                                                            注:當插入片段的長度<2 kb時,可省略復蘇步驟(步驟4),直接將轉化后的菌液涂布在含氨芐青霉素的平板上,37℃培養過夜。

                                                            5、取200 ul菌液,涂布于含氨芐青霉素的平板上37℃培養過夜。

                                                            注:若想獲得更多克隆,可將菌液低速(3000 g)離心2 min,棄掉部分上清液,用移液器吹打至菌體完全重懸,吸取全部菌液涂布于含氨芐青霉素的平板上,37℃培養過夜。

                                                             

                                                            檢測:

                                                            1、菌落PCR法(無菌操作):

                                                            1)挑選單菌落至10 μl無菌水中,充分混勻。

                                                            2)取2 μl菌液作為PCR反應的模板,用試劑盒提供的M13F/M13R引物擴增插入片段。

                                                            3PCR反應條件

                                                                 94  2 min

                                                                 94  30 sec

                                                                 56  30 sec    30 cycles

                                                                 72  1 kb/min  (根據片段大小確定延伸時間)

                                                                 72  10 min

                                                            4)電泳檢測PCR產物,若載體自連,則擴增出的片段大小為143 bp

                                                            5)確定重組子后將剩余的8 μl菌液轉接到LB培養基中(含相應的抗生素),搖菌培養過夜,然后提取質粒進行測序。

                                                            2、限制性酶切法:

                                                            1)挑取單克隆至LB培養基中(含相應抗生素),過夜搖菌,抽提質粒。

                                                            2)用EcoRI/EcoRV/PstI或合適的限制性內切酶,對質粒進行酶切,鑒定重組子。

                                                             

                                                            測序:

                                                                用M13FM13R通用引物測序,然后進行序列分析。

                                                                   M13F5-TGTAAAACGACGGCCAGT-3

                                                                   M13R5-CAGGAAACAGCTATGACC-3

                                                             

                                                            四、常見問題分析:

                                                            重組子克隆菌少,或陽性率低:

                                                            1、感受態效率低:使用轉化效率>5×107fcu/μg的感受態細胞;

                                                            2、連接反應在低溫下(如碎冰上)操作:應在室溫下操作;

                                                            3、連接反應時間過長:室溫下放置5min即可,時間過長效率會下降;

                                                            4PCR產物加入量太少或太多:按照推薦量加入;

                                                            5PCR產物純度低:重新擴增或重新純化PCR產物;

                                                            6PCR產物質量低,切膠十紫外照射時間長:使用藍光切膠儀切膠或加快切膠速度,減少PCR產物在紫外下暴露的時間;

                                                            7、轉化后沒有做復蘇:可加入LB培養基(無抗生素)震蕩培養60min

                                                            8、克隆基因可能對宿主菌有毒性,比如某些編碼膜蛋白和DNA結合蛋白的基因,某些啟動子和調節序列基因,或含有倒置或串聯重復序列的基因:選用室溫過夜培養平板。

                                                             

                                                            附:載體圖譜


                                                             


                                                             

                                                             

                                                            ?

                                                            京公網安備 11011402011307號

                                                            免费国产美女一级A片下载,丁香婷婷激情综合俺也去,天堂俺去俺来也官网,一级aa片,一级片黄色录像,天天爽一爽a,看全色黄大色黄大片,日本高清色本在线www